高效液相色譜法的應用

高效液相色譜法(HPLC)因具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點，并且隨著一系列衍生化方法的開發使用，尤其對非揮發性物質，其應用以越來越廣。與經典的液相色譜相比它具有以下優點：

（一）速度快

通常分析一個樣品需要15-20分鐘，有些樣品甚至在5分鐘之內即可完成一次分析。

（二）分辨率高

可選擇固定相和流動相已達到最佳分離效果。

（三）靈敏度高

可采用不同的檢測器已達到所需靈敏度要求。通常紫外檢測器可達到10g，熒光和化學檢測器可達10g。

（四）

用一根色譜柱可分離不同的化合物，使用后珠子也可能變壞，這取決于樣品的類型、溶劑的性質和操作的情況。

（五）樣品容易回收

樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

用高效液相色譜法（HPLC）對樣品進行分析之前，首先必須建立適合該樣品分析的方法；即依據樣品的來源、性質、進行適當的處理后，選擇合適的色譜柱和流動相及檢測器對樣品進行分析。

1、樣品的性質 樣品中待測組分的分子量大小、化學結構、溶解性等化學、物理性質決定著色譜分離類型的選擇。對樣品的性質分析是建立方法的前提。

若樣品組成縫份簡單時，可直接進行分析，只要待測組分可與其他成分分開即可。

當組成成分復雜干擾待測組分測定時，必須對樣品進行純化處理，或除去干擾組分或提取待測組分。尤其是生物樣品的分析往往必須經過適當的預處理后才能分析待測組分。

2、色譜分離類型的選擇 高效液相色譜法（以下檢測HPLC）中色譜柱和流動相的選擇必須依據標準品的性質。

3、溶劑的選擇與處理 流動相溶劑要求純度高；粘度小；對樣品有適宜的溶解度；不引起注銷損失且與檢測器相匹配。使用前溶劑必須進行純化和脫氣處理。

HPLC分析時通常采用混合溶劑提高分離選擇性。HPLC流動相系統中的PH值范圍一般為2.5-7.5，因此溶劑系統往往采用低濃度的緩沖溶液，最常用的緩沖溶液時醋酸鹽和磷酸鹽緩沖液。由于該類緩沖液溶液易發霉，因此最好現用現配或置冰箱貯存。】

在分析復雜樣品時可采用梯度洗脫方法，即按一定程度連續或間斷改變流動相的組成使色譜分離效率提高，峰型改善，分析速度加快。

4、檢測器的選擇 在HPLC檢測中，當樣品有紫外吸收時，常選用紫外檢測器。當樣品本生或經過衍生化反應后能夠產生熒光時常選用熒光檢測器。電化學檢測器使用于氧化還原性的物質檢測。熒光或電化學檢測器可使檢測靈敏度提高2-3個數量級。

中國藥典從1985年開始收載1HPLC方法，只有七個項目，全部用于含量測定；后來HPLC在藥典中的收載項目不斷增多，不僅用于含量測定，也用于鑒別和雜質檢查等。1990年版藥典收載中鑒別9項，雜質檢測12項，含量測定達到55項；1995年版藥典收載集聚增加，鑒別34項，檢查48項，含量測定104項。

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