PCR擴增DNA片段

聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction ,PCR)是一種體外DNA 擴增技術，1985年由Mullis等人創立。該技術能在幾小時的實驗操作中，將認為選定的一段DNA擴增幾百萬被，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和應用廣泛等優點、可用于基因克隆、定點突變及序列分析。也可用于基因表達調控研究、遺傳病和傳染病基因診斷、基因多態性分析和法醫鑒定等領域。

PCR的工作原理類似于DNA的天然復制過程，這將代待擴增的DNA片段和其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經變性、退火及延伸三部反應的多次循環，可使特定的DNA片段在數量上呈指數增加。可用公式Y=(1+X)表示，式中Y=DNA擴增倍數，X=擴增效率，n=循環數。如X=100%,n=20時，Y=1048576倍。PCR的一個循環為（1）加熱使模板DNA在高溫（94℃）下變性，雙鏈解開，這是變性階段；（2）降低溶液溫度，使引物在低溫下（50℃）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是退火階段；（3）溶液溫度升至中溫（72℃），在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，引物為復制七點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。通過改變反應溫度即高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個階段，構成PCR的一個循環。╮(╯_╰)╭循環一次，特定DNA片段拷貝數擴大一倍。一般30次循環，DNA片段放大數百萬倍。

試劑

購買TaqDNA聚合酶，10x擴增緩沖液，dNTP.

設計并合成與目的DNA兩側互補的引物。

制備模板DNA。用牙簽挑取單菌落懸浮到50ul的裂解液中（裂解液1%Triton X-100,20mmol/L Tris·Cl ph8.2 2mmol/L EDTA),95℃，10000rpm離心5min ，取5ul上清液用于總體積100ul的PCR反應。

器械

PCR擴增儀

臺式高速離心機

移液器

經高壓滅菌后的離心管

電泳儀

實驗方法

1、按一下次序，將下列成分在0.5ml滅菌離心管內混合

滅菌水                                  30ul

10x擴增緩沖液                           10ul

4種dNTP混合物，每種濃度為1.25mmol/L   16ul

引物1                                   100pmol

引物2                                   100pmol

模板DNA                                5ul

加水至終體積                            100ul

2、于94℃加熱反應混合液5min，使DNA完全變性。

3、將1ul TaqDNA聚合酶加入仍處于94℃的反應混合也中。

4、用100ul石蠟油覆蓋于反應混合液之上，放置水蒸發。

5、按94℃變性1min，50℃退火2min，72℃延伸3min次序重復魂環25-30次（為克隆目的）。末輪循環的72℃延伸時間為10min。

6、取出樣品離心管，自然冷卻后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定或置-20℃保存。若有必要，可將移液器吸頭深入下層水相，將含DNA的水相移入一清潔管中，用等體積三氯甲烷抽提樣品以除去石蠟油。

注意事項：

1、TaqDNA聚合酶應在臨擴增前現加。

2、擴增前需充分混勻反應混合液。

3、所用離心管需經高壓滅菌。

4、PCR反應特異性強，引物濃度不宜過多。

5、引物設計要合理，一般引物長度為18-30個核苷酸，成對引物間的G+C含量應相似。

原創作者：青島捷世康生物科技有限公司