醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白
目的要求
（1）、學習醋酸纖維素薄膜電泳原理
（2）、掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白的操作技術
實驗原理
醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。它具有簡便、快速、樣品用量少，應用范圍廣，分離清晰，沒有吸附現象等優點。目前已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析檢測，是醫學和臨床檢驗的常規技術。
本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有白蛋白、a-球蛋白、B-球蛋白、Y-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質由于氨基酸組成、相對分子質量、等電點及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳，染色后可顯示5條區帶。其中白蛋白的泳動速度最快，其余依次為a1-、a2-、B-及Y-球蛋白。這些區帶經洗脫后可直接進行光吸收掃描自動繪出區帶吸收峰及相對百分比。
試劑和器材
（1）、試劑
巴比妥緩沖液：巴比妥1.66g，巴比妥鈉12.76g，加水至1000mL。置4℃冰箱保存，備用。
染色液：氨基黑10B0.5g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，蒸餾水40mL，混勻。
漂洗液：95%乙醇45mL，冰醋酸5mL，蒸餾水50mL，混勻。
透明液：冰醋酸25mL，無水乙醇75mL，混勻
（2）、材料
新鮮血清
（3）、器材
醋酸纖維薄膜，培養皿，點樣器，電泳儀，玻璃板，粗濾紙，鉛筆和直尺，竹鑷子
操作方法
（1）、浸泡。用鑷子取醋酸纖維薄膜1張，小心平放在盛有緩沖液的平皿中，浸泡30min左右。
（2）、點樣。將浸透的薄膜從緩沖液取出，夾在兩層粗濾紙內吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣時，先在點樣器上均勻地沾上血清，再將點樣器輕輕地印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。點樣區距陰極端1.5cm。
（3）、電泳。根據電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電泳緩沖液中。當濾紙全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋。將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（注意：點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。通電，調節電流強度0.4～0.6mA/cm膜寬度，電泳時間約為1～1.5h。
（4）、染色。電泳完畢后將薄膜取下，放在染色液中浸泡10min。
（5）、漂洗。將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中洗數次，直至背景藍色脫洗。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機將薄膜吹干。
（6）、透明。將脫色吹干后的薄膜浸入透明液中，浸泡2～3min后，取出緊貼于潔凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，干后即為透明的薄膜圖譜。
注意事項
（1）、市售醋酸纖維素薄膜均勻干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。若漂浮液面的薄膜在15～30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。
（2）、醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.05～0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關。緩沖液濃度過低，則區帶泳動速度快區帶擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區帶泳動速度慢，區帶分布過于集中，不易分辨。
（3）、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散。但不宜太干，否則樣品不易進入膜內，造成點樣起始點參差不起，影響分離效果。
（4）、點樣時，動作不要輕、穩，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區帶分離效果。
（5）、電泳時應選擇合適的電流強度，一般電流強度為0.4～0.6mA/cm膜寬度，電流強度高，則熱效應高；電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。
（6）、操作過程為防止指紋污染，應戴手套。
原創作者：青島捷世康生物科技有限公司
技術支持:阿儀網
