革蘭鑒別染色法
點(diǎn)擊次數(shù)：1164 日期：2015/9/17 9:41:49
微生物染色方法一般分為單染色法、復(fù)染色法、特殊染色法及負(fù)染色法。單染色法是用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物；復(fù)染色法則采用兩種或兩種以上的染料，將不同微生物染成不同顏色以鑒別微生物，常用的有革蘭染色法和抗酸染色法；負(fù)染色法則使微生物背景著色；特殊染色法可將細(xì)菌各部分結(jié)構(gòu)染成特定顏色。實(shí)驗(yàn)材料方法一 革蘭鑒別染色法1．菌種：大腸桿菌，枯草桿菌(經(jīng)20h培養(yǎng)的肉汁斜面或平板培養(yǎng)物)革蘭染色各步驟的作用及結(jié)果為革蘭染色程序表。 革蘭染色程序操作步驟和使用的試劑處理時間
與細(xì)胞所起的反應(yīng)鏡檢細(xì)胞觀察到
的現(xiàn)象革蘭陽性細(xì)菌(G+)革蘭陰性細(xì)菌(G—)涂片與火焰固定細(xì)胞蛋白質(zhì)疑固與革蘭陽性菌相同無色甲紫染色45—60s1．染料為細(xì)胞吸附，
以結(jié)合和不結(jié)合
兩種形式吸附2．細(xì)胞成紫色與革蘭陽性菌相同紫色碘液染色(媒染)1rain1．碘反應(yīng)，即可能固
定結(jié)合或不結(jié)合
甲紫2．形成一種碘甲紫
復(fù)合沉淀物3．細(xì)胞仍為紫色與革蘭陽性菌相同紫色脫色(乙醇或乙醇丙酮混合物)小心地一滴一滴地點(diǎn)到標(biāo)本上，直到不出現(xiàn)紫色液溢出1．脫色液引起碘甲
紫復(fù)合物離解2．復(fù)合物的成分成
為可溶性3．厚的細(xì)胞壁呈現(xiàn)
脫水4．染料的擴(kuò)散慢慢
進(jìn)行l(wèi)，2．與革蘭陽性菌
相同3．薄的細(xì)胞鞘呈現(xiàn)
脫水4．染料的擴(kuò)散很快
進(jìn)行革蘭陽性紫色革蘭陰性無色復(fù)染(蕃紅或稀的石炭酸復(fù)紅)0．5一lmin1．稍有出現(xiàn)甲紫被
取代，但總的細(xì)胞
群不受影響2．細(xì)胞呈現(xiàn)紫色或
紅色1．原甲紫染色部位
被取代2．細(xì)胞被復(fù)染3．細(xì)胞呈紅色革蘭陽性紫色革蘭陰性紅色
在進(jìn)行革蘭染色中有時結(jié)果不穩(wěn)定，主要的原因是脫色時間掌握不當(dāng)，涂片太厚，或菌齡太長，一般采用20—24h的培養(yǎng)物。染色操作步驟及注意點(diǎn)
從革蘭染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脫色、復(fù)染、水洗、干燥等步驟，每一步都具有其操作要點(diǎn)和注意點(diǎn)，若不當(dāng)心，可能就得不到滿意的結(jié)果。
1．制片：制片要采用干凈的載玻片，并注意接種環(huán)的無菌操作。做斜面菌體片時，要防止菌體和水混合不均勻有結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，注意菌體量適中。
2．固定：涂片后最好先在室溫下自然干燥，然后固定。固定的目的是：①殺死微生物，固定其細(xì)胞結(jié)構(gòu)；②保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，因而可防止標(biāo)本被沖洗掉；③改變菌體對染料的通透性，一般使死細(xì)胞原生質(zhì)染色。
(1)固定常用高溫，手執(zhí)載玻片一側(cè)，標(biāo)本面朝上，在火焰外層快速來回通過3—4次。共約3—4s，要求玻面溫度不超過60~C，此時以手背皮膚接觸不覺過燙為度。放置待冷后染色。由于熱固定會改變細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外形，所以研究菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)時常采用化學(xué)固定法。 、
(2)常用的化學(xué)固定劑有：95％乙醇、乙醇和醚1：l的混合液、丙酮、l％一2％餓酸液。適用于固定絲狀菌的固定液介紹兩種：①鉻酸一醋酸一餓酸液：鉻酸坨，冰醋酸坨，l％餓酸lml；②鉻酸一醋酸一甲醛溶液：1％鉻酸80ral，冰醋酸5ml，甲醛溶液15ml。
鋨酸能很快固定細(xì)菌細(xì)胞而不改變其結(jié)構(gòu)，因此用它來固定微生物細(xì)胞很方便。
3．媒染與染色：標(biāo)本固定以后，滴加染色液，使整個標(biāo)本固定在染色液中。染色時間視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時還需加熱。一般染色時間為l一3rain。
如作復(fù)合染色，要在染色前作媒染處理。媒染劑與染料能形成不溶性的化合物，它能增加染料和細(xì)胞的親和力(表12—3)。媒染一般在固定后進(jìn)行，但也可結(jié)合固定或染色同時進(jìn)行。表12-3 各種媒染劑的作用媒染液名稱 作 用醋酸(少量)氯化鋇(2％一4％)硅鎢酸(4％水溶液)碳化鏗(少量)碘和苦味酸增加曙紅、胭脂紅的染色酸性染色劑的染色堿性染色劑的染色增進(jìn)減性染料染色各種紫色染媒，染色后用
4．脫色與復(fù)染：一般脫色都用醇類和酸類處理，通常可以檢查染料與細(xì)胞結(jié)合的程度。用以鑒定菌類，常見的脫色劑是95％的乙醇，3％的鹽酸液。
脫色后需再用一種染色劑染色，它能與脫色的部分形成鮮明對比，便于區(qū)別觀察。革蘭染色中可以用萎紅液或石炭酸品紅等作復(fù)染液。
5．水洗與干燥：染色時間一到，就應(yīng)用細(xì)小的緩流水將多余染料從標(biāo)本上洗去，但不要將細(xì)胞所吸附的染料洗去。洗凈后，將標(biāo)本放置桌上風(fēng)干，也可用吸水紙輕輕吸去水分。有時也可微微加熱，待干后再鏡檢。
6．標(biāo)本玻片的封藏：標(biāo)本鏡檢后，有時需要長期保存，這時應(yīng)將標(biāo)本封存。常用的制片黏著劑是加拿大膠，其制法是：混合等量的干加拿大膠和碳酸氫鈉在乳缽內(nèi)磨碎，加入等量二甲苯，制成透明溶液，約l周后過濾，并微熱，使溶液具適當(dāng)稠度。保存在暗處，并外涂黑色。將此液滴加到標(biāo)本中，上蓋清潔蓋玻片，壓平，待干，保存。用此種中和性的加拿大膠保藏標(biāo)本，不易褪色。
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