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線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

點擊次數(shù)：1195　日期：2016/10/24 9:02:16

線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

分光光度法 25 管/24 樣

測定意義

線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測定原理

復合體Ⅴ水解 ATP 產(chǎn)生 ADP 和 Pi，通過測定 Pi 增加速率來測定復合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：25mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：1 mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.3mL 蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;試劑五：6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分混勻;試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻;試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻;試劑九：液體 10mL×1 瓶，室溫保存。

定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心 10min。

4 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做）。

5 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 800uL 試劑二和 8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復 30 次），用于復合體Ⅴ酶活性測定。

測定步驟

1、酶促反應

試劑名稱（μL）			對照管	測定管

試劑四			50	50

試劑五			200	200

樣本				250

混勻， 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準確水浴 30min

試劑六			100	100

樣本			250

	混勻，4000g，室溫離心 10min，取上清液
2、定磷
上清液		250		250
定磷試劑		1250		1250

混勻，室溫靜置 10min 左右，在 660nm 處讀取 A 測定管和 A 對照管，計算ΔA=A 測定管-A對照管。

復合體Ⅴ活性計算

標準條件下測定的回歸方程為 y = 1.2487x + 0.0361；x 為標準品濃度（mmol/L），y 為 A 值。1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。復合體Ⅴ活性（U/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(V 樣×Cpr) ÷T =64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（U/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。復合體Ⅴ活性（U/10⁴ cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.103× (ΔA-0.0361)

V 反總：反應體系總體積，6×10^-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.25 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應時

間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。

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