貨號：H0142

規格：50T/48S

注意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

產品內容：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體32mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體25mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體25mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：氯仿，自備。    

亞硝酸鈉標準品：液體1mL×1支，4℃保存。10μmol/mL亞硝酸鈉。

產品說明：

生物體內超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導的作用，但積累過多時會對細胞膜及生物大分子產生破壞作用，導致機體細胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應生成NO2－，NO2－在對氨基苯磺酰胺和萘乙二胺鹽酸鹽的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在530nm有特征吸收峰，根據A530值可以計算樣品中O2－含量。

自備實驗用品及儀器：天平、水浴鍋、離心機、可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、氯仿和蒸餾水。

操作步驟：

一、超氧陰離子提取

1.植物、動物組織：稱取約0.1g樣本，加入提取液1mL，充分研磨，12000rpm，4℃，離心20min，取20μL上清測定蛋白含量，其余上清作為待測樣本。

2.血清或培養液：直接測定

二、測定操作表

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至530nm，蒸餾水調零。

2、標準溶液的制備

稱取適量亞硝酸鈉標準液，首先16倍稀釋至 0.625µmol/mL,然后進行倍比稀釋至 0.3125、0.15625、 0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.0049、0.00244、0.0012、0.0006µmol/mL 梯度稀釋的標準溶液， 用0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.00244、0.0006µmol/mL 標準管做標準曲線。

3、操作表

三、超氧陰離子含量計算公式

1.標準曲線的繪制

以∆A 標準為 y 軸，標準溶液濃度為 x 軸，繪制標準曲線 y=kx+b。

2.超氧陰離子含量的計算

將∆A 樣品帶入方程得到 x 值（µmol/mL）

（1） 按照樣本鮮重計算

超氧陰離子含量（µmol/g鮮重）= 2x×V 樣本÷（V 樣本÷V 提取×W）=2x÷W。

超氧陰離子產生速率（µmol/ min/g鮮重）= 2x×V 樣本÷（V 樣本÷V 提取×W）÷T=0.1x÷W。

（2） 按照蛋白質濃度計算

超氧陰離子含量（µmol/min/mg prot）= 2x×V 樣本÷（V樣本×Cpr）=2x÷Cpr。

超氧陰離子產生速率（µmol/min/mg prot）= 2x×V樣本÷（V 樣本×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr。

(3) 按照血清或培養液體積計算

超氧陰離子含量（µmol/mL）= 2x

超氧陰離子產生速率（µmol/min/mL）= 2x÷T=0.1x。

V 樣本：參與反應樣本體積，0.2mL；V提取：提取過程中加入的提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品鮮重，g；T：反應時間，20min。

注意事項：

1、OD值大于1.0，樣品適當稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數。

2、樣品制備好之后，立刻進行測定，請勿將樣品進行長時間的低溫保存，以免影響測定結果。

3、試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護措施。